临床研究模版
·临床研究·
基于移动医疗的居家运动康复对改善肝癌术后患者
肌力及生活质量的效果观察*
余恺涛1，2 王君俏2 殷保兵3 林奕芳1 林嘉莉1 周钰馨1 温湘祥1，2 贾 杰1，4，5，6
DOI:10.3969/j.issn.1001-1242.2025.10.004
*基金项目：国家重点研发计划项目（2018YFC2002300）
1 复旦大学附属华山医院康复医学科，上海市，200040； 2 复旦大学护理学院； 3 复旦大学附属华山医院肝胆外科； 4 福建医科大学附属第一医院康复医学科； 5 国家老年疾病临床医学研究中心（华山医院）； 6 通讯作者
第一作者简介：余恺涛，男，硕士研究生； 收稿日期：2024-05-26
摘要
目的：探讨基于移动医疗的居家运动康复应用于肝癌手术患者出院后下肢肌力和生活质量的影响。
方法：选取2022年6月—2023年8月于两家三甲医院行手术治疗的肝癌患者100例，其中对照组50例，干预组50例，分别指导其进行3周居家运动锻炼。对照组给予居家康复运动手册指导，干预组在此运动处方的基础上制定基于移动医疗的运动康复，干预后比较两组的肌力和生活质量水平。
结果：基于移动医疗的运动康复的患者在干预3周后下肢肌力显著高于对照组（P<0.05），生活质量领域中的疲劳和恶心呕吐症状较对照组均得到显著性改善（P<0.05）。
结论：基于移动医疗的居家运动康复可有效改善肝癌手术患者出院后下肢肌力下降、疲劳和恶心呕吐症状，是提高肝癌出院后患者康复的有效途径。
关键词 肝肿瘤；运动康复；移动医疗；下肢肌力；生活质量
中图分类号：R493，R735.7 文献标识码：A 文章编号：1001-1242(2025)-10-1474-08
Evaluation on the effect of mHealth-based home exercise rehabilitation on improving muscle strength and quality of life in postoperative patients with hepatocellular carcinoma/YU Kaitao， WANG Junqiao， YIN Baobing， et al.//Chinese Journal of Rehabilitation Medicine， 2025， 40（10）：1474—1481
Abstract
Objective： To explore the effects of mHealth-based home exercise rehabilitation on lower limb muscle strength and quality of life in liver cancer surgery patients after discharge from the hospital.
Method： One hundred cases of hepatocellular carcinoma patients who underwent surgery in two tertiary hospitals from June 2022 to August 2023 were selected， including 50 cases in the control group and 50 cases in the intervention group. The patients were instructed to carry out home exercise for 3 weeks respectively. The control group was given a home rehabilitation exercise manual， while the intervention group developed mHealth-based exercise rehabilitation based on this exercise prescription. The muscle strength and quality of life levels of the two groups were compared after the intervention.
Result： Patients with mHealth-based exercise rehabilitation had significantly higher lower limb muscle strength than the control group after 3 weeks of intervention （P<0.05）. The fatigue and nausea, and vomiting symptoms in the quality of life domains were significantly improved compared with the control group （P<0.05）.
Conclusion： Home-based exercise rehabilitation based on mHealth can effectively improve lower limb muscle strength， fatigue, and nausea and vomiting symptoms in patients discharged from the hospital after surgery for hepatocellular carcinoma. It is an effective way to improve the rehabilitation of patients discharged from the hospital for hepatocellular carcinoma.
Author's address Department of Rehabilitation Medicine，Huashan Hospital Affiliated to Fudan University，Shanghai，200040
Key word liver neoplasms； exercise rehabilitation； mobile health； lower limb muscle strength； quality of life
肝癌手术患者因受疾病及手术的不良影响，术后急性期常存在骨骼肌减少及肌力下降的问题，导致术后活动能力的下降和卧床时间的增加，严重影响其生活质量[1—2]。近年来国内外众多研究均证实运动康复对肿瘤术后患者改善的重要性、安全性和有效性，美国癌症协会也积极推荐癌症患者积极进行运动锻炼[3—5]。但目前患者仍存在运动依从性不高的问题[6]，对于肝癌手术患者来说，术后开展科学有效的康复运动训练，同时配备提高运动依从性的干预媒介，有望提高患者术后肌力的同时，改善其生活质量并延长生存时间。
移动医疗（mobile health，mHealth）最早由Robert提出，是指通过移动通信技术，如数字设备、移动电话等来提供相关医疗卫生服务和相关信息[7]。随着信息技术的高速发展和各种资源的共享，移动医疗因具有高效性、系统性和便捷性等特性而被广泛应用于健康管理的各个领域[8]。目前国内外有大量研究表明，移动医疗可以作为改善患者居家运动依从性的媒介[9—11]。国内关于移动医疗的报道仍较有限，目前尚缺乏在肝癌术后康复治疗方面的研究[12]。因此，本研究旨在探究基于移动医疗的居家运动康复对肝癌患者术后下肢肌力和生活质量的改善效果。本研究获得复旦大学附属华山医院伦理委员会（2021-794）的批准，并于中国临床试验注册中心进行了注册（ChiCTR2100052911）。
1 研究对象
选取2022年6月—2023年8月入住两所三甲医院肝胆外科的肝癌患者，以患者就诊及招募次序分配随机序号，分为移动医疗组和对照组。两组样本量比值1∶1，参考预试验研究，以干预前后5次坐立试验时间差值作为计算依据，两组干预前后组间差值为2.43（1.03，4.01）s，假设α=0.05，统计学功效power=0.80，通过G*Power软件[13]计算得到最少需要样本量为82例，考虑到15%的脱落率及其他不确定因素，计划每组纳入48例受试者。最终有100例患者完成试验（试验组50例、对照组50例），入组患者均签署知情同意书，试验过程中未发生不良事件与不良反应。
纳入标准：①原发性肝癌预计进行2个及以上肝段切除（4级手术）的患者；②进展期肝癌（2、3期）开放和腹腔镜手术患者；③年龄18岁以上；④经转化治疗后的原发性肝癌患者；⑤Child-Pugh A或能耐受根治性手术的肝癌患者；⑥既往有肿瘤病史经治疗后3年内未见复发的原发性肝癌患者；⑦拥有智能手机，且可自己操作或在家属协助下操作；⑧签署知情同意书，自愿参加本项研究者。
排除标准：①存在任何运动可能加重或导致不良影响的疾病或症状；②肝癌远处转移或既往有肿瘤病史经治疗后3年内的患者；③认知功能障碍或心理疾病导致不能正常使用软件的患者。
2 研究方法
2.1 研究方法
通过前期文献回顾进行证据总结并开展专家论证会，外科团队和康复医学团队制定肝癌手术患者居家康复训练方案，运动康复方案内容框架遵循FITT原则进行构建。FITT原则是指运动处方应包括运动频率（frequency）、运动强度（intensity）、运动时间（time）、运动类型（type）4个要素，结合指南建议的运动类型，确定肝癌术后运动康复方案的内容框架为：运动包含运动前评估、有氧运动、抗阻运动、拉伸训练和运动检测与随访；运动阶段分为热身动作、拉伸运动、全身运动和整理运动4个阶段。患者进行每周3—5次，每次30—50min的运动康复训练，并每隔1周联系患者反馈训练情况，每次运动累计达靶心率时间≥30min，每周目标时间≥90min；运动强度建议在热身和整理阶段选择低强度动作，在全身活动中选择中等强度动作，详见表1。
对照组：①出院前由管床护士进行常规健康指导；②发放上述制定的运动处方术后康复手册，并由康复治疗师在出院前1天进行讲解，同时为每位患者配上弹力带；从手术1周后到3周内，患者进行借助康复手册进行训练，同时发放运动日记监督患者将每天的训练情况进行打卡。研究人员在患者出院前指导患者进行上述康复动作，同时并讲解表格填写方法与要求，嘱门诊随访时交回，患者于出院后第3周末门诊随访。
试验组：出院前常规健康指导同对照组；试验组应用移动医疗管理患者，并结合可穿戴设备和弹力带帮助患者进行居家运动康复。
①干预实施前准备：患者出院前1天，出院前指导患者在手机应用商城下载“术康”APP软件，通过输入激活码与研究者进行绑定，填写基本信息后正式进入“肝癌术后居家运动康复管理系统”，研究者在“术康”APP中设定上述方案中的运动处方内容（包括运动的强度、时间、类型、运动动作），将动作内容在出院前指导患者掌握并将运动处方发送至患者端。同时设定好靶心率与报警心率，结合使用心率带实时监测患者运动中的心率，如有异常及时报警，同时也记录患者总的运动时间和维持在靶心率中的有效运动时间，汇总的运动记录可实时记录患者的运动总时长，维持在靶心率中的运动时长，运动后患者自评 Borg分级和患者运动感受。数据可及时同步到医护端。软件可自动记录患者的运动总时长，并显示实时心率和目标靶心率区间，目标靶心率的计算方法为：（220－年龄）×（64%—76%）[14]。
②干预内容：该运动处方可提供康复运动项目的视频动作，并配有详细操作的文字说明和语音提示，操作使用简便友好。居家阶段患者在APP指导下按计划完成运动处方，运动过程中绑定心率带保证安全和运动有效性。运动结束患者可通过APP进行反馈，研究者收到反馈后可以通过APP远程调整处方内容，患者的运动内容均可同步到研究者端便于记录。从出院到出院后3周内，借由移动医疗，远程监督与指导患者进行推荐患者运动时长为每天30—50min，运动频率为3—5次/天，运动总量为不少于90min/周。患者于出院后第3周末门诊随访。
2.2 评价方法
2.2.1 一般资料调查表（self-made General Situation Questionnaire，SGSQ）：包括姓名、性别、年龄、文化程度等一般社会人口学资料。
2.2.2 运动依从性：运动依从性目前没有统一的运动依从性量表，本研究根据所构建的运动康复方案、干预组APP后台的运动记录时长和对照组的运动日记情况反馈，将达到每周建议运动总时间的80%及以上的患者视为依从性高，达到每周建议运动总时间的40%及以上的患者视为依从性中等，运动总时间为40%以下的患者视为依从性低。
2.2.3 5次坐立试验（five times sit to stand test，FTSTS test）：下肢肌力采用5次坐立试验进行评估，用于评估个体下肢肌力、平衡和运动能力。具体测量方法为准备一把高度为45cm的座椅，受试者被指导双臂交叉放在胸前，背靠椅子坐着。在指导者的口令下最快速度重复5次坐站测试动作，第5次后受试者的身体接触到椅子时即停止计时，记录时间。5次坐立试验是一种可靠的评估下肢肌肉力量和平衡的方法，适用范围广泛[15]。
2.2.4 生活质量量表（European Organization for Research and Treatment of Cancer Quality of Life Questionnaire 30-Item Core Instrument，EORTC QLQ-C30）：癌症患者生命质量测定量表EORTC QLQ-C30（QLQ-C30）是欧洲癌症研究治疗组织（European Organization for Research and Treatment of Cancer，EORTC）开发的癌症患者生命质量测定量表体系中的核心量表，用于所有癌症患者的生命质量测定。QLQ-C30共30个条目，包括15个领域，其中5个功能领域（躯体功能、角色功能、认知功能、情绪功能、社会功能）、3个症状领域（疲劳、疼痛恶心呕吐）、1个总健康状况领域以及6个单一条目（气促、失眠、食欲缺乏、便秘、腹泻、经济困难）。功能领域和总健康状况领域得分越高表明功能状态越好、生命质量越好。相反，症状领域及单一条目得分越高表明症状越明显、生命质量越差。该量表各维度的Cronbach's a系数为0.746—0.878，各维度重测信度为0.733—0.897[16]。
所有入组患者在术前一天完成一般人口学资料和病历资料收集，于出院3周后门诊复查时进行评估患者的体力活动情况和生活质量情况。
2.3 统计学分析
采用SPSS 22.0进行统计学分析，计量资料符合正态分布用均数±标准差表示，组间比较采用两独立样本t检验，组内干预前后自身比较采用配对t检验，符合非正态分布用中位数、四分位数表示，组间比较采用非参数秩和检验，有序多分类变量采用χ2检验，以双侧α=0.05为检验水准，P＜0.05为具有显著性差异。对于失访患者的资料处理使用意向性分析方法，失访患者的数据采用KNN插补法进行缺失值填补。
3 结果
3.1 研究对象招募与流失情况
在2022年6月—2023年8月期间，共有254例患者通过纳排标准和患者意愿进行筛查，最终共有100例患者愿意加入本研究，其中50例患者被分配到对照组，50例患者进入到试验组。在后续随访中，试验组中有5例患者失访，其中1例失去联系，1例因时间原因未能随访，1例自行退出，2例因对心率带过敏退出。对照组中有4例患者失访，其中2例失去联系，1例去世，1例自行退出。
3.2 两组患者基本资料及相关数据比较
试验组患者年龄为(54.6±10.6)岁，45例男性（90.0%）；对照组患者年龄为(56.4±9.7)岁，40例男性（80.0%）。两组患者的性别、年龄、血压史、血糖史、收入、乙肝感染史、受教育程度、工作类型的比较，均无显著性差异（P>0.05），见表2。
3.3 两组患者手术资料及相关数据比较
研究中患者的手术资料中，手术方式、手术时间、术中出血量、肿瘤分类和住院天数两组之间无显著性差异（P＞0.05），见表3。
3.4 两组患者康复依从性比较
采用χ2检验对两组患者运动依从性进行组间比较，结果显示，两组患者在3周的干预过程中，从运动依从性中比较发现，试验组患者的高依从率为36%，对照组的高依从率为12%；χ2检验显示，试验组患者的运动依从性显著高于对照组，见表4。
3.5 基线和干预后两组患者5次坐站试验时间比较
试验组和对照组干预在3周后，试验组5次坐站试验时间降低了（0.78±4.86）s（P=0.303）；对照组增加了（1.26±5.35）s（P=0.12）。两组的5次坐站试验时间在基线和干预后均显著变化。组间比较结果显示，两组之间5次坐站试验时间改变之间具有显著性差异，见表5。
3.6 基线和干预后两组患者癌症生活质量比较
t检验显示，两组患者的基线生活质量各个维度和指标均无显著性差异（P>0.05）；干预3周后，试验组的生活质量显著优于对照组；在功能层面，试验组的恢复能力与对照组相对均无显著性差异（P>0.05）；在症状层面，试验组患者的疲劳、恶心呕吐情况显著优于对照组（P<0.05），见表6。
4 讨论
4.1 基于移动医疗的肝癌术后居家运动康复的有效性
本研究招募了100例肝癌术后患者完成随机对照试验，以检验基于移动医疗的居家运动康复是否可以提高肝癌术后患者的下肢肌力，并改善其生存质量。经过3周居家运动锻炼，本研究发现相较于居家康复运动手册指导，基于移动医疗的居家运动康复可以显著改善患者的下肢肌力，疲劳和恶心呕吐症状。
5次坐立试验是近年来在国际上普遍认可的一种用于综合评价患者下肢功能性力量和平衡功能的测试方法[17—18]。研究表明5次坐立试验时长与下肢肌肉含量存在明显的负相关，目前已广泛应用于癌症患者的肌力评估[14，19—20]。肝癌手术患者下肢肌力水平较普通人偏低，患者在经历重大腹部手术和长时间卧床后，进一步损害其下肢肌力和平衡功能，而术后运动康复对患者的肌力和平衡恢复具有积极意义[21—22]。本研究发现，试验组的患者在经过基于移动医疗的运动康复训练后能进一步减少5次坐立时长，而对照组较干预前增加相应时长，表明试验组的下肢肌力在干预后显著高于对照组，这与Yoon Kim[23]的研究结果一致。
本研究采用欧洲癌症患者生命质量测定量表来评价研究对象的生活质量，该量表分功能维度和症状维度，其中症状量表及单项的得分越高，表明症状越明显，生活质量越差。本研究中，两组患者在术后均出现疲劳程度上升，但试验组的疲劳加重情况显著弱于对照组（P=0.03），说明相较于康复指导手册，基于移动医疗的康复干预可以更好地缓解肝癌术后疲乏的加重。肝癌患者常出现过度且持续的精神和（或）身体虚弱或疲乏[24]。而运动训练可刺激骨骼肌，提升适应能力，提高身体素质，减少疲劳感。Oken[25]研究也发现运动康复可以增强肿瘤患者的肌力并改善疲劳。恶心呕吐是肝癌患者常见的症状之一。本研究发现，基于移动医疗的运动康复患者其恶心呕吐症状有所改善，而对照组患者的恶心呕吐症状则呈加重趋势，具有显著性差异（P=0.02）。有效的运动康复在提升心肺适能的同时，也改善个体整体状态，进而改善症状和功能，提升生活质量。
4.2 基于移动医疗肝癌术后居家运动康复的优势
本研究开发的基于移动医疗的肝癌术后居家运动康复，一方面通过虚拟现实成像，将康复动作制作成以视频动画为媒介的运动处方，加之语音提示和详尽的内容提示为患者提供了更为直观细致的指导，患者运动的准确性也可能优于康复指导手册，从而激发患者的康复兴趣和动力，提高其身体活动水平和动作的规范性；另一方面，在基于移动医疗的康复训练过程中，APP后台可以自动记录患者心率带的监测数据，传输给医生端可以帮助医护人员了解患者运动状况，必要时予以反馈和指导；而患者端可实时掌握自身运动水平，提高运动规范性和安全性。
4.3 基于移动医疗的肝癌术后居家运动康复的可推广性
肝癌患者的术后生存率在不断提高，术后运动康复干预对肝癌患者的疾病恢复和生活质量具有重要影响[26—27]。研究表明，运动康复可以帮助患者增强患者术后活动积极性，摆脱围手术期带来的不适，并帮助患者恢复生活能力[28—29]。考虑安全性，临床上较多患者和家属往往倾向于拒绝或推迟运动康复，并未在第一时间给予运动康复治疗。本研究在充分了解肝癌手术患者出院后运动康复方面的需求后，首次将康复运动内容整合入APP，设计了针对肝癌手术患者出院后运动康复管理的应用程序，根据患者的运动状况，调整运动干预方式、运动类型、运动时间等，其不仅具有指导便捷性的优点，还可以及时起到反馈监督的作用，保证患者居家运动的安全。本研究中试验组患者在出院后3周，居家治疗并接受基于移动医疗的康复指导期间，无须返回医院进行康复训练或者康复咨询，在一定程度上克服了时间和空间障碍，让患者远程便可获得优质的医护服务，而且移动医疗也减少医疗成本，尤其对于肝癌术后这类需要长时间运动康复的患者。
本研究的局限性在于干预周期较短，测量工具较单一，依从性的衡量指标为运动总时长而非维持在靶心率中的运动时间，且对照组患者是采用运动日记自我报告记录运动情况，具有一定的主观性。研究者将继续延长干预时间，优化测量工具，并进一步观察其远期效果。
5 结论
相比于运动手册指导下的康复训练，基于移动医疗的居家运动康复可有效提高肝癌患者的下肢肌力和生活质量。
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基础研究模版
·基础研究·
带针下有氧运动通过NLRP 3/Caspase-1/GSDMD调节小胶质细胞焦亡改善MCAO/R大鼠认知功能的机制研究*
陈 白1，2 程 静1，2 江一静1，2 饶 婷1，3 林淑芳1，2 杨珊莉1，2，4
DOI:10.3969/j.issn.1001-1242.2025.03.002
*基金项目：国家自然科学基金项目（82074513）；福建省自然科学基金计划项目（2021J01958）；福建省自然科学基金计划项目（2021J01955）
1 福建中医药大学附属康复医院，福建省福州市，350003； 2 福建省康复技术重点实验室； 3 福建中医药大学； 4 通讯作者
第一作者简介：陈白，女，硕士研究生，主治医师； 收稿日期：2024-07-24
摘要
目的：观察带针下有氧运动对大脑中动脉闭塞再灌注（MCAO/R）大鼠学习记忆能力的影响并探索相关作用机制。
方法：SD雄性大鼠随机等分为假手术组、模型组、带针下有氧运动组和抑制剂组，每组12只。假手术组大鼠仅暴露左侧颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉，其余三组大鼠制备左侧大脑MCAO/R模型。抑制剂组造模前60min需腹腔注射MCC 950以复制NLRP 3低表达MCAO/R大鼠。于造模第1天采用Zea-Longa评分法及小动物磁共振T2 WI筛选合格MCAO/R大鼠。于造模第2天对带针下有氧运动组、抑制剂组大鼠进行为期14d干预，穴取“神庭”“百会”，疏密波形，频率2/10Hz，电流强度1—3mA，同时将大鼠置于电动跑道，干预后1—3d跑台速度4m/min，4—7d跑台速度6m/min，8—14d跑台速度8m/min，每天30min。干预后再次评定神经功能；新物体识别实验检测学习记忆能力；HE染色观察缺血侧海马病理形态改变；Western Blot法、免疫荧光法检测缺血侧海马NLRP 3、GSDMD、Caspase-1蛋白表达；Elisa法检测促炎因子IL-1β、IL-18含量；免疫荧光双标法检测IBA 1及NLRP 3表达及定位情况。
结果：模型组大鼠缺血侧海马细胞排列疏松紊乱；与假手术组相比，模型组大鼠神经功能及新物体识别能力显著下降（P<0.01），缺血侧海马NLRP 3、GSDMD、Caspase-1蛋白表达显著增加（P<0.01），IL-1β、IL-18含量显著增加（P<0.01），另外IBA 1、NLRP 3荧光表达显著增强（P<0.01），镜下可见大量IBA 1+/NLRP 3+双阳性细胞（P<0.01）；与模型组相比，带针下有氧运动组神经功能评分及新物体识别指数显著增加（P<0.05，P<0.01）；海马病理损伤减轻；NLRP 3、GSDMD及Caspase-1蛋白表达下降（P<0.01）；IL-1β及IL-18含量降低（P<0.05）；小胶质细胞活化程度及IBA 1+/NLRP 3+双阳性细胞数量减少（P<0.01）；抑制剂组大鼠的神经功能及新物体识别能力较带针下有氧运动组进一步恢复（P<0.05，P<0.01），NLRP 3、GSDMD、Caspase-1蛋白表达（P<0.01）及IL-1β、IL-18因子水平显著下降（P<0.01，P<0.05），小胶质细胞活化水平、神经细胞数量、排列及形态均趋于假手术组，镜下几乎未观察到有NLRP 3表达的小胶质细胞（P<0.01）。
结论：“神庭”“百会”带针下有氧运动可能通过抑制小胶质细胞焦亡和活化，进而下调神经炎症水平，改善MACO/R大鼠大学习记忆功能。
关键词 学习记忆功能障碍；带针下有氧运动；小胶质细胞焦亡；神经炎症；小胶质细胞活化
中图分类号：R493，R743.3 文献标识码：A 文章编号：1001-1242(2025)-03-0326-10
Mechanism of aerobic exercise with acupuncture needles in improving cognitive function via NLRP 3/Caspase-1/GSDMD-mediated modulation of microglia pyroptosis in middle cerebral artery occlusion/reperfusion rats/CHEN Bai， CHENG Jing， JIANG Yijing， et al.//Chinese Journal of Rehabilitation Medicine，2025，40（3）： 326—335
Abstract
Objective：To investigate the effect of aerobic exercise with acupuncture needles on the learning and memory ability in rats subjected to middle cerebral artery occlusion/reperfusion（MCAO/R） and to explore the underlying mechanisms.
Method： Male SD rats were randomly divided into four groups: sham，model，aerobic exercise with acupuncture needles，and inhibitor groups(n=12 per group). In the sham group, only the left common carotid artery，internal carotid ar tery，and external carotid artery were exposed without inducing ischemia，while the other three groups underwent MCAO/R modeling. To establish an MCAO/R model with reduced NLRP3 expression, rats in the inhibitor group received an intraperitoneal injection of MCC950 60 minutes before modeling. On the first day of post-modeling， the Zea-Longa score and T2 WI were used to screen the MCAO/R rats. From the second day， rats in the aerobic exercise with acupuncture needles and the inhibitor groups were underwent a 14-day intervention. The acupoints were selected for “Shenting”（GV 24）and “Baihui”（GV 20），with sparse waveform at a frequency 2/10Hz and a current intensity of 1—3mA. Simultaneously，the rats performed treadmill exercise, with speeds of 4m/min (day 1—3)，6m/min (day 4—7)，and 8m/min (day 8—14) for 30min/day. After the intervention， neurological function was reassessed， and the new object recognition test was used to measure the learning and memory ability，and the pathological changes of the hippocampus were observed by HE staining. The protein expressions of NLRP 3，GSDMD，and Caspase-1 were detected by Western Blot and immunofluorescence，ELISA detected the contents of IL-1β and IL-18，the expression and localization of IBA 1 and NLRP 3 were detected by double immunofluorescent staining.
Result：The hippocampal neurons in the ischemic side of the rats were loosely and disorderly arranged in the model group. Compared to the sham group, the model group showed significantly impaired neurological function and novel object recognition ability（P<0.01），with significant increased expression of NLRP 3，GSDMD，and Caspase-1（P<0.01），and elevated IL-1β and IL-18 contents（P<0.01）. In addition，IBA 1 and NLRP 3 fluorescence expression were enhanced（P<0.01），and many IBA 1+/NLRP 3+ double-positive cells were observed under the microscope（P<0.01）. Compared with the model group，the aerobic exercise with acupuncture needles group showed significant improvements in neurological function and the new object recognition index（P<0.05, P<0.01），reduced hippocampal pathological injury，decreased expression of NLRP 3，GSDMD，and Caspase-1 d（P<0.01） and lower IL-1β and IL-18 levels （P<0.05）; the activation of microglia and the expression of IBA 1，NLRP 3 and the number of IBA 1+/NLRP 3+double-positive cells decreased（P<0.01）. The inhibitor group demonstrated even greater improvements in neural function and new object recognition performance than the aerobic exercise with acupuncture needles group（P<0.05， P<0.01）， with further reductions in NLRP 3， GSDMD， Caspase-1 protein expression（P<0.01） and lower level of IL-1β，IL-18（P<0.01，P<0.05）; the microglia activation level，the number，arrangement and morphology of nerve cells were closely resembled those in the sham group，and there was minimal NLRP 3 microglia observed under the microscope（P<0.01）.
Conclusion： Aerobic exercise with acupuncture needles at “Shenting” （GV 24） and “Baihui” （GV 20） points could improve the learning and memory function in MACO/R rats by inhibiting microglia pyroptosis and activation， thereby reducing neuroinflammation.
Author's address Fujian University of Traditional Chinese Medicine Subsidiary Rehabilitation Hospital， Fuzhou， Fujian， 350003
Key word learning and memory dysfunction； aerobic exercise with needles； microglia pyroptosis； neuroinflammation； microglia activation
脑卒中后认知障碍（post-stroke cognitive impairment，PSCI）是脑卒中患者的主要并发症之一，同时也是增加包括脑卒中和死亡在内的复发性血管事件风险的重要原因[1]。有研究表明，持续性神经炎症是缺血性脑卒中和相关痴呆所致认知障碍的关键病理特征[2]。作为脑缺血后神经炎症反应的关键调节因子，NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3， NLRP 3）主要由小胶质细胞产生，在识别病原体相关分子模式和危险相关分子模式后即发生组装，最终形成NLRP 3炎症小体多蛋白复合物[3]。近年来，研究确定了NLRP 3炎症小体介导的经典小胶质细胞焦亡途径参与了PSCI的发生和进展，此外，NLRP 3炎症小体在小胶质细胞活化中也起着关键作用[4—5]。NLRP 3下调或沉默的大脑中动脉闭塞再灌注（middle cerebral artery occlusion/reperfusion，MCAO/R）大鼠在很大程度上受到保护，免受空间记忆障碍、海马突触可塑性丧失、相关行为障碍和其他与脑缺血相关的后果[6—7]。
目前，电针“神庭”“百会”及有氧训练改善PSCI的临床疗效已得到了充分论证[8—9]，在此基础上形成的头穴带针/留针下运动训练治疗PSCI的研究日益增多[10]。作为一种中西医结合的康复方式，有氧训练与头针同步实施操作相对简单，禁忌证少，且无毒副作用，患者易于接受且少受痛楚，在临床PSCI康复治疗中具备独特优势和潜力，但其作用机制是否涉及NLRP 3炎症小体介导的经典小胶质细胞焦亡尚不明晰。因此，本研究旨在观察“神庭”“百会”带针下有氧运动对MCAO/R大鼠缺血侧海马经典焦亡因子NLRP 3、天冬氨酸蛋白水解酶1（cysteinyl aspartate specific proteinase-1，Caspase-1）、消皮素D（gasdermin D，GSDMD）表达及下游促炎因子含量的影响，并判断焦亡发生的细胞类型，以探索“神庭”“百会”带针下有氧运动改善MCAO/R大鼠学习记忆功能可能的作用机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物与分组
选用SPF级2—3月龄雄性SD大鼠进行实验，体质量280—330g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，生产许可证号：SCXK（沪）2022—0004。实验动物饲养于福建中医药大学实验动物中心，实施12h昼夜循环照明系统，室温20—24℃，空间相对湿度45%—65%，声音在55dB以内，以确保其生活环境的舒适与适宜。本研究已通过福建中医药大学实验动物伦理委员会批准（批准文号：FJTCM IACUC 2022056），实验过程严格遵循中华人民共和国动物处置规定。
为了匹配大鼠体重和线栓的规格，造模前适应性饲养大鼠约10天至目标体重，随机分为假手术组、模型组、带针下有氧运动组和抑制剂组，每组12只。
1.2 主要仪器与试剂
主要仪器：7.0 T小动物磁共振成像仪（BioSpec 70/20 USR，德国BRUKER公司）；新物体识别测试系统、小动物跑步机（上海欣软信息科技有限公司）；高速冷冻离心机（Centrifuge 5424 R，德国Eppendorf 股份公司）；酶标仪（TECAN SPARK，上海帝肯贸易有限公司）；智能生物荧光显微镜（DM4000B，德国徕卡公司）；电针仪（SDZ-Ⅲ型）及针灸针（0.25—13mm）均购自苏州医疗用品厂有限公司；电泳仪、电转仪、化学发光成像系统、酶标仪（美国Bio-Rad公司）。
主要试剂：异氟烷购自深圳市瑞沃德生命科技有限公司；戊巴比妥钠（P 3761）购自美国Sigma公司；MCC 950（HY-12815）购自美国MCE生物科技公司；白细胞介素-18（IL-18）ELISA试剂盒（EK 0592）、白细胞介素-1β（IL-1β）ELISA试剂盒（EK 0393）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（AR 0146）均购自武汉博士德生物工程有限公司；NLRP 3抗体（AF 300649）、Caspase-1抗体（AF 00021）、IBA 1抗体（AF 09772）、多重免疫荧光试剂盒（AFIHC 034）购自湖南艾方生物科技有限公司；GSDMD抗体（ab 219800）购自英国Abcam公司；GAPDH抗体（60004-1-Ig）、HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）（SA 00001-2）、HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG（H+L）（SA 00001-1）均购自美国Proteintech公司；HE 染色试剂盒（G 1120）购自北京索莱宝科技有限公司。
1.3 造模方法
于造模前12h对各组大鼠进行禁食不禁水管理。造模前60min配置终浓度为6.25mg/ml的 MCC 950，抑制剂组大鼠腹腔注射50mg/kg的 MCC 950以复制NLRP 3低表达MCAO/R大鼠，其余三组腹腔注射等体积的0.1M PBS（pH=7.4）溶液。以大鼠左侧大脑中动脉为目标栓塞区，参考改良Longa线栓阻塞法[11]制备MACO/R大鼠模型。闭塞90min后将线栓拔出约10—12mm以实现再灌注过程。假手术组大鼠分离左侧相同动脉后缝合保温即可。
1.4 干预方法
带针下有氧运动组和抑制剂组：术后第2天对大鼠进行“神庭”“百会”带针下跑台训练干预，为大鼠佩戴宠物背带式牵引绳以降低干预过程中的脱针机率（见图1）。参考《实验动物常用穴位名称与定位》[12]于大鼠头部前正中线位置取“神庭”“百会”进针，“神庭”向后斜刺2—3mm，“百会”向“神庭”方向斜刺2—3mm。电针仪导电线夹正负极分别连接两穴位针柄末端后，设定电针仪参数：疏密波形，频率2/10Hz，电流强度1—3mA[8]，同时将大鼠置于电动跑道，设定跑步机参数：干预第1—3天跑台速度设置为4m/min；第4—7天跑台速度设置为6m/min；第8—14天跑台速度设置为8m/min[13]。每天训练30min，于上午相同时间段进行，连续14天。
假手术组和模型组：进行每日模拟抓取及牵引绳佩戴，放置在跑道上自由活动30min，连续14天。
1.5 取材及指标检测
神经功能评分：待大鼠苏醒后，参考Zea-Longa 5级评分法评估各组大鼠的神经功能，进行MCAO/R模型的初次筛选，剔除得分为0分或4分。干预结束后再次记录各组大鼠的神经功能评分。
小动物磁共振扫描：初步筛选出的神经功能1—3分大鼠于造模后24h进行7.0 T MRI扫描，为满足实验动物“3R原则”（替代、减少、优化）和统计学的前提，每组随机选取6只大鼠，以大鼠左侧脑室出现明显高信号梗死灶作为MCAO/R模型第二次筛选的标准。异氟烷充分麻醉后将大鼠以俯卧位固定于磁共振扫描床，采集脑定位及T2加权成像扫描（T2-weighted imaging，T2 WI）图像，采用快速自旋回波（Turbro RARE）序列[14]，以观察术后大鼠脑区有无梗死灶及梗死灶具体情况。选取各组大鼠Bergma层面一致的大脑皮层进行梗死灶勾画及脑梗死体积百分比计算。
脑梗死体积百分比=梗死灶体积/全脑体积×100%。
新物体识别实验：为与小动物磁共振扫描数据进行匹配并满足统计学的前提，干预结束后每组随机选取6只大鼠进行新物体识别测试。第1天为适应期，将各组大鼠置于测试箱内自由活动600s；第2天为学习期，将物体A、物体B置于测试箱角落，大鼠背朝物体出发进行600s探索。第三天为测试期，将物体B替换为颜色相同形态不同的物体C，使用Super Maze动物行为学视频分析系统记录大鼠在300s内对物体A、物体C的探究次数及活动轨迹。物体A的探究次数记为TA，物体C的探究次数记为TC。
新物体识别指数=TC/（TA+TC）×100%
取材：新物体识别实验结束后进行取材，取材内容包括新鲜取材（左侧/缺血侧海马）及灌注取材（全脑）。根据指标检测的样本需求，各组随机取6只大鼠充分麻醉（戊巴比妥钠30 mg/kg ip）断头后迅速取出脑组织，预冷生理盐水冲洗后于冰上迅速剥离左侧海马，并置于提前标记的1.5ml离心管中，储存在﹣80℃冰箱待Western Blot检测和ELISA检测。各组随机取6只大鼠充分麻醉（戊巴比妥钠30mg/kg ip）后进行心脏灌注，灌注内容包括150ml 0.9%生理盐水及150ml预冷4%多聚甲醛。灌注结束后完整取出的全脑置于装有多聚甲醛的50ml离心管固定24h，纯水冲洗后修切，进行常规脱水、石蜡包埋及组织切片（切片厚度4μm），经烤片30min、烘片2h后室温存放待HE染色和免疫荧光单标及共标实验。
HE染色观察大鼠缺血侧海马神经元形态：制备的组织切片依次经过二甲苯脱蜡、乙醇溶液水化、苏木素定染细胞核、分化、反蓝处理、乙醇溶液脱水、伊红染色细胞质和细胞外基质、乙醇溶液脱水、二甲苯透明、树胶封片。低倍显微镜定位切片的缺血侧海马区域后切换高倍显微镜观察该区域神经元细胞的形态及数量并采集图像。
Western Blot 检测缺血侧海马NLRP 3、GSDMD蛋白表达水平：海马组织充分裂解后4℃ 10000r/min离心15min，吸取上清液用于BCA蛋白浓度测定及后续Western Blot实验。配置10% SDS-PAGE凝胶并根据BCA测定结果确定各组上样量，随后进行恒压电泳（30V，15min、80V，30min、120V，45min）、400mA恒流转膜（GSDMD快速转膜20min，NLRP 3快速转膜30min）、封闭（GSDMD快速封闭15min，NLRP 3脱脂牛奶封闭1h）、一抗孵育（GAPDH 1∶5000、NLRP 3 1∶1500、GSDMD 1∶1000）、TBST洗膜（10min×3）、二抗孵育（1∶5000）、TBST洗膜（10min×3），随后进行显影，通过Bio-Rad凝胶成像系统获取图像，Image Lab软件分析条带，得出目的蛋白与GAPDH内参蛋白灰度比值，以此作为目的蛋白相对表达量。
ELISA检测大鼠缺血侧海马促炎因子IL-1β、IL-18含量：取出冻存的海马组织样本于预冷PBS（pH=7.4）溶液中清洗后称重，按照每1g样本加入5ml PBS的比例，对组织进行充分研磨，得到的组织匀浆液于5000r/min离心15min，吸取上清液进行IL-1β、IL-18含量测定。
免疫荧光法检测缺血侧海马Caspase-1、IBA 1、NLRP 3表达水平及IBA 1与NLRP 3的定位情况：制备的组织切片依次经过脱蜡脱水处理（二甲苯、乙醇梯度溶液、蒸馏水）、热抗原修复、内源性过氧化物酶阻断（3% H2O2）、非特异性靶点封闭（3%牛血清白蛋白）、一抗孵育过夜（Caspase-1 1∶150、 IBA 1 1∶200）、二抗孵育、荧光染料1染色（即用型TYR-570）。第2天IBA 1孵育脑组织进行第二轮标记，重复抗原修复、内源性过氧化物酶阻断和非特异性靶点封闭过程后，进行第二种一抗孵育过夜（NLRP 3）、二抗孵育、荧光染料2染色（即用型TYR-520）、DAPI标记细胞核和封片。第2天Caspase-1孵育脑组织进行二抗孵育、DAPI标记细胞核和封片。使用荧光显微镜观察各组大鼠缺血侧海马并采集该区域不同荧光通道及组合图像。使用Image J软件进行累计光密度（integrated option density，IOD）测量及双阳性细胞计数，最后进行统计分析。
1.6 统计学分析
SPSS 25.0软件进行数据统计分析，采用GraphPad Prism 9.4.1软件作图。计量资料符合正态分布时采用均数±标准差表示，服从正态分布则组内比较采用配对t检验，多组间采用单因素方差分析比较，采用LSD-t检验或Dunnett-t检验进行两两比较。以P<0.05为有显著性差异。
2 结果
2.1 各组大鼠干预前后神经功能评分比较
干预前，与假手术组相比，模型组、带针下有氧运动组和抑制剂组MCAO/R大鼠出现明显的神经功能的受损症状（P<0.01）。干预后，各组MCAO/R大鼠的神经功能可见不同程度恢复。与模型组相比，带针下有氧运动组大鼠的神经功能评分显著降低（P<0.05）；与带针下有氧运动组相比，抑制剂组大鼠神经功能缺损减轻更明显，且差异显著（P<0.05）。见表1。
2.2 各组大鼠干预前脑梗死情况比较
造模后24h，假手术组大鼠脑区未见异常信号表达，且左右脑室对称；模型组、带针下有氧运动组及抑制剂组大鼠左侧脑室出现异常高信号梗死灶，梗死灶范围累及左侧大脑皮层及海马等结构，见图2。三组MCAO/R大鼠脑梗死体积百分比无显著差异（P>0.05）；与假手术组相比，三组MCAO/R造模大鼠脑梗死体积百分比显著升高（P<0.01）。见表2。
2.3 各组大鼠新物体识别能力比较
与假手术组相比，模型组大鼠新物体识别指数显著降低（P<0.01）；带针下有氧运动干预显著提高了MCAO/R大鼠的新物体识别能力（P<0.01）；抑制剂组大鼠的新物体识别指数较带针下有氧运动组有进一步提高，且差异显著（P<0.01）。见表3。
2.4 各组大鼠缺血侧海马病理形态改变
假手术组大鼠左侧海马神经细胞形态数量正常，胞质染色呈均匀淡粉色；模型组大鼠缺血侧海马观察到多数神经元细胞胞质嗜伊红呈深染，并可见大量空泡样变性细胞、皱缩细胞及核固缩细胞；带针下有氧运动组大鼠缺血侧海马形态异常及炎性细胞数量较模型组减少，病理损伤减轻；抑制剂组大鼠海马大多数细胞结构恢复正常，细胞数量及排列情况趋于假手术组。见图3。
2.5 各组大鼠缺血侧海马焦亡因子表达比较
2.5.1 各组大鼠缺血侧海马NLRP 3、GSDMD蛋白表达：与假手术组相比，模型组大鼠缺血侧海马NLRP 3、GSDMD表达出现显著升高（P<0.01）；经带针下有氧运动干预14天后，大鼠缺血侧海马NLRP 3、GSDMD表达下降，且与模型组差异显著（P<0.01）；抑制剂组大鼠缺血侧海马NLRP 3、GSDMD表达水平较带针下有氧运动组出现进一步降低，且差异显著（P<0.01）。见图4，表4。
2.5.2 各组大鼠缺血侧海马Caspase-1表达比较：免疫荧光结果显示，模型组大鼠缺血侧海马Caspase-1表达较假手术组显著升高（P<0.01）；经带针下有氧运动干预14天后，大鼠缺血侧海马Caspase-1表达降低，且与模型组差异显著（P<0.01）；与带针下有氧运动组相比，抑制剂组大鼠缺血侧海马Caspase-1表达出现进一步下降，且差异显著（P<0.01）。见图5，表5。
2.6 各组大鼠缺血侧海马促炎因子IL-1β、IL-18含量比较
与假手术组相比，模型组大鼠缺血侧海马IL-1β、IL-18显著增加（P<0.01）；经带针下有氧运动干预后，大鼠缺血侧海马IL-1β、IL-18含量出现显著下降（P<0.05）；与带针下有氧运动大鼠相比，抑制剂组大鼠缺血侧海马IL-1β、IL-18含量出现进一步降低，且差异显著（P<0.01或P<0.05）。见表6。
2.7 各组大鼠缺血侧海马IBA 1与NLRP 3表达及共定位情况比较
假手术组大鼠缺血侧海马小胶质细胞多处于“静息态”，呈高度分枝状，具有多级分枝结构；与假手术组相比，模型组大鼠缺血侧海马小胶质细胞多处于“激活态”，细胞突起变短或消失，IBA 1及NLRP 3表达显著增加（P<0.01），且镜下可见大量IBA 1+/NLRP 3+双阳性细胞（P<0.01）；经带针下有氧运动干预后，缺血侧海马区域部分小胶质细胞恢复“静息态”，可见一级或二级突起分枝，IBA 1和GSDMD的荧光强度均显著下降（P<0.01），镜下IBA 1+/GSDMD+双阳性细胞数量较模型组减少，且差异显著（P<0.01）；与带针下有氧运动组相比，抑制剂组大鼠缺血侧海马IBA 1及NLRP 3显著下降（P<0.05），镜下几乎未见有NLRP 3表达的小胶质细胞（P<0.01）。见图6，表7。
3 讨论
自2015年起，脑卒中已成为中国人口死亡和残疾的主要原因[15]。另外，由于人口老龄化以及糖尿病和高血压等脑卒中相关危险因素的患病率不断增加，中国的脑卒中疾病负担仍在上升[16]。除了专注于降低脑卒中发生率外，改善幸存者后遗症也是脑卒中临床康复的重要内容。PSCI作为血管性认知障碍的主要部分，影响多达一半的卒中患者，近年来受到越来越多的关注[17]。药物治疗常伴发不良反应及传统非药物康复训练疗效的不稳定性促使新疗法不断出现，临床上也逐渐将中西结合理念应用于PSCI康复并取得良好疗效[18]。头穴带针/留针下有氧训练是临床治疗脑卒中后遗症常见的中西医结合康复方法。
神庭穴，神之所处，百神之王。百会穴，百脉所汇，阳气所聚之处。神庭、百会作为督脉循行至头部的要穴，常被合用治疗PSCI，二穴合用可调阴阳，醒神智，有祛瘀生新、填精养神之功。“刺之要，气至而有效”，为实现针刺效应量足够的需求，临床上在针刺/电针得气后常进行留针操作。已有临床研究证实，百会、神庭穴电针后留针可以有效促进脑卒中患者的认知功能重建，此良效归因于缺血侧脑区侧支循环的有效开放及神经活动的恢复[19]。百会穴留针大鼠在水迷宫测试中也具有更良好的表现[20]。有氧运动作为脑卒中最佳实践推荐的干预措施，也被报道可以改善卒中患者的反应能力和认知功能[21—22]，并可以改善脑卒中动物模型的记忆功能，与保护缺带针下有氧运动是将针灸之“静”与有氧训练之“动”相结合的方式，可以在患者进行主观能动训练的同时保持头针的持续刺激作用，增强大脑可塑性，使患者的脑循环及功能重组得以改善，纠正中风后的阴阳失衡，是具备显著优势和潜力的脑卒中临床康复方案[26]。本研究在此基础上进行了干预方案的优化，让大鼠在接受“神庭”“百会”电针的同时进行同步有氧训练，以保证刺激条件的持续稳定。行为学评估结果显示，单纯干预组大鼠的新物体识别表现明显优于模型组，神经功能评分及HE染色结果同样验证了带针下有氧运动的神经保护作用，包括减轻神经功能缺损、增加缺血侧海马神经元完整性。
作为一种促炎形式程序性细胞死亡方式，细胞焦亡与PSCI发展的相关性已得到充分研究[5，27]。已有充分证据表明，缺血脑组织的细胞焦亡水平取决于炎症小体的激活程度[28]，其中NLRP 3炎症小体是最重要的焦亡激活调节因子。经缺血缺氧诱导活化的NLRP 3炎症小体会招募前体Caspase-1（Pro-caspase-1），Pro-caspase-1会以炎症小体为平台进行自动催化水解，促使自身转化为活性Caspase-1，裂解活化促炎细胞因子（如pro-IL-1β和pro-IL-18）并解除焦亡关键执行蛋白GSDMD的自身抑制状态[29]。形成的N末端结构域会易位至细胞膜并发生寡聚，形成内径约为10—14nm的非选择性通道，造成细胞膜完整性的丧失，并触发细胞焦亡和细胞内促炎物质的分泌，从而诱导炎症级联反应或启动炎症细胞死亡过程，加重缺血性脑损伤[30]。目前研究表明，通过多途径包括调控大脑线粒体功能、离子紊乱及氧化应激水平等沉默或抑制NLRP 3炎症小体激活可以有效保护血脑屏障，从而逆转脑缺血大鼠的认知障碍和记忆功能恶化[31—34]。基于此，本实验设置了NLRP 3低表达抑制剂组以进行进一步机制探索。带针下有氧运动组大鼠缺血侧海马焦亡因子NLRP 3、Caspase-1和GSDMD表达减少，结合Elisa结果中IL-1β、IL-18含量下降，可以推断“神庭”“百会”带针下跑台训练可能通过下调缺血侧海马细胞焦亡水平发挥脑保护作用。抑制剂组大鼠表现出更明显的新物体探索倾向，进一步肯定了带针下有氧运动的治疗作用与细胞焦亡水平下调有关。
作为对神经炎症具有强烈敏感性的关键免疫细胞，小胶质细胞是导致PSCI发生进展的主要细胞类型[35]。在脑缺血发生初期小胶质细胞即启动活化过程，并诱发焦亡发生，促炎因子大量释放形成的促炎环境对脑组织具有强烈破坏性[32]。本实验中，模型组大鼠缺血侧海马可见大量处于激活态的小胶质细胞，同时可见小胶质细胞中的NLRP 3炎症小体大量激活，而带针下跑台训练下调了同侧海马区域IBA 1、NLRP 3表达及IBA 1+/NLRP 3+双阳性细胞数量，抑制剂的使用进一步抑制了小胶质细胞的激活，促进了海马区域的神经恢复。
综上，“神庭”“百会”带针下有氧运动对MCAO/R大鼠神经功能保护及认知功能的改善作用可能归因于NLRP 3炎症小体诱导的小胶质细胞焦亡和小胶质细胞活化下调，两者协同降低了缺血侧海马神经炎症水平。目前探究头针带针状态下行有氧训练在PSCI患者中应用效果的国内报道较少，本研究为临床相关研究提供了前期实践基础。后续应对大鼠其他脑区进行同等研究，并结合细胞实验、电镜实验等多层面观察小胶质细胞焦亡的发生。
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